La Pinacoteca Ambrosiana fu fondata nel 1618 dal Cardinale Federico Borromeo, cugino dell'arcivescovo canonizzato Carlo Borromeo, diventando così una delle più antiche gallerie d'arte pubbliche d'Europa — anticipando l'apertura al pubblico degli Uffizi di quasi due secoli. Borromeo la concepì non semplicemente come una collezione di prestigio, ma come un'istituzione civica per la formazione artistica, collocandola deliberatamente accanto alla Biblioteca Ambrosiana, da lui inaugurata nel 1609. Il complesso occupa il Palazzo dell'Ambrosiana in Piazza Pio XI, a soli cinque minuti a piedi a sudovest del Duomo, e le sue 24 sale ospitano oltre 1.500 disegni e dipinti accumulati nel corso di quattro secoli di mecenatismo attento e dotto.
I capolavori assoluti della collezione abbracciano due discipline distinte. In ambito pittorico, il Canestro di frutta di Caravaggio (c. 1599) rappresenta l'unica natura morta indipendente mai realizzata dall'artista — una rottura radicale con l'arte narrativa, in cui foglie in decomposizione e fichi maturi portano lo stesso peso morale di un'allegoria religiosa. Il monumentale cartone preparatorio di Raffaello per La Scuola di Atene (1509–1510) occupa un'intera parete; largo circa 7,6 metri, è il più grande disegno rinascimentale conosciuto ancora esistente, che rivela ogni pentimento e ogni revisione compositiva apportata da Raffaello prima di trasferire il disegno alla Stanza della Segnatura nei Musei Vaticani. La galleria conserva inoltre opere significative di Tiziano, Botticelli, Bramantino e Jan Brueghel il Vecchio, le cui pitture floreali realizzate in collaborazione con Rubens documentano lo scambio artistico fiammingo-italiano che Borromeo promosse attivamente.
Il tesoro più straordinario del museo è tuttavia il Codice Atlantico — una raccolta rilegata di 1.119 fogli di disegni e scritti di Leonardo da Vinci, assemblata dallo scultore Pompeo Leoni tra il 1582 e il 1590. Prende il nome dalle sue dimensioni simili a quelle di un atlante, abbraccia sei decenni della produzione di Leonardo (c. 1478–1519) e comprende studi sul volo, l'idraulica, l'ingegneria militare, la botanica e la geometria. Napoleone lo requisì per Parigi nel 1796; fu restituito a Milano nel 1815, uno dei pochi grandi capolavori a sopravvivere intatto alle requisizioni francesi. I visitatori possono esaminare pagine in facsimile esposte a rotazione, che offrono un'impressione diretta dell'intelletto irrequieto e multidisciplinare di Leonardo.
Rispetto alla Pinacoteca di Brera a Milano o agli Uffizi a Firenze, l'Ambrosiana accoglie un numero relativamente contenuto di visitatori, il che rende l'esperienza straordinariamente intima — le sale con soffitti a cassettoni in legno e un'illuminazione calda e controllata permettono uno studio tranquillo delle singole opere. Si consigliano da 1,5 a 2 ore di visita. Il museo si trova in Piazza Pio XI 2, a pochi passi dalla fermata metro M1/M3 del Duomo. L'acquisto anticipato dei biglietti è consigliato nei fine settimana, ma raramente si esauriscono nelle mattinate infrasettimanali. La Biblioteca Ambrosiana, accessibile attraverso il museo, richiede un appuntamento di ricerca separato per gli studiosi, ma la facciata della sala di lettura è visibile dal cortile.