A Pinacoteca Ambrosiana foi fundada em 1618 pelo Cardeal Federico Borromeo, primo do canonizado Arcebispo Carlo Borromeo, tornando-se uma das mais antigas galerias de arte públicas da Europa — inaugurada quase dois séculos antes da abertura pública dos Uffizi. Borromeo concebeu-a não apenas como uma coleção de prestígio, mas como uma instituição cívica dedicada à educação artística, colocando-a deliberadamente ao lado da Biblioteca Ambrosiana, inaugurada em 1609. O complexo ocupa o Palazzo dell'Ambrosiana na Piazza Pio XI, a apenas cinco minutos a pé a sudoeste do Duomo, e as suas 24 salas abrigam mais de 1.500 desenhos e pinturas acumulados ao longo de quatro séculos de mecenato criterioso e erudito.
As joias da coroa da coleção abrangem duas disciplinas distintas. Em pintura, a Cesta de Frutas (c. 1599) de Caravaggio é a única natureza-morta independente que ele jamais produziu — uma ruptura radical com a arte narrativa, na qual folhas murchas e figos demasiado maduros carregam o mesmo peso moral que uma alegoria religiosa. O monumental cartão preparatório de Rafael para A Escola de Atenas (1509–1510) ocupa uma parede inteira; com cerca de 7,6 metros de largura, é o maior desenho renascentista sobrevivente conhecido, revelando cada pentimento e revisão compositiva que Rafael fez antes de transferir o projeto para a Stanza della Segnatura do Vaticano. A galeria também possui obras significativas de Ticiano, Botticelli, Bramantino e Jan Brueghel, o Velho, cujas pinturas florais em colaboração com Rubens documentam o intercâmbio artístico flamengo-italiano que Borromeo ativamente fomentou.
O tesouro mais singular do museu, porém, é o Codex Atlanticus — uma coleção encadernada de 1.119 folhas de desenhos e escritos de Leonardo da Vinci, reunida pelo escultor Pompeo Leoni entre 1582 e 1590. Batizado em referência às suas dimensões de atlas, abrange seis décadas da produção de Leonardo (c. 1478–1519) e engloba estudos sobre voo, hidráulica, engenharia militar, botânica e geometria. Napoleão requisitou-o para Paris em 1796; foi devolvido a Milão em 1815, sendo uma das poucas obras importantes a sobreviver intacta às requisições francesas. Os visitantes podem examinar páginas em fac-símile em rotatividade, tendo uma perceção direta do intelecto inquieto e multidisciplinar de Leonardo.
Em comparação com a Brera de Milão ou os Uffizi de Florença, a Ambrosiana recebe um público relativamente modesto, o que torna a experiência invulgarmente íntima — salas com tetos artesonados em madeira e iluminação quente e controlada permitem o estudo tranquilo de obras individuais. Planeie entre 1h30 e 2 horas. O museu fica localizado na Piazza Pio XI 2, a poucos minutos a pé da estação de metro do Duomo (M1/M3). A compra antecipada de bilhetes é recomendada aos fins de semana, mas raramente esgota nas manhãs de dias úteis. A Biblioteca Ambrosiana, acessível através do museu, requer uma marcação de investigação separada para académicos, mas a fachada da sua sala de leitura é visível a partir do pátio.