La Pinacothèque Ambrosienne fut fondée en 1618 par le cardinal Federico Borromeo, cousin de l'archevêque canonisé Carlo Borromeo, ce qui en fait l'une des plus anciennes galeries d'art public d'Europe — devançant l'ouverture publique des Offices de près de deux siècles. Borromeo la conçut non pas simplement comme une collection de prestige, mais comme une institution civique vouée à l'éducation artistique, en la plaçant délibérément à côté de la Bibliothèque Ambrosienne, qu'il avait inaugurée en 1609. Le complexe occupe le Palazzo dell'Ambrosiana sur la Piazza Pio XI, à cinq minutes à pied au sud-ouest du Dôme, et ses 24 salles renferment plus de 1 500 dessins et peintures accumulés au fil de quatre siècles d'un mécénat délibéré et érudit.
Les joyaux de la collection couvrent deux disciplines distinctes. En peinture, la Corbeille de fruits de Caravage (v. 1599) constitue la seule nature morte indépendante qu'il ait jamais réalisée — une rupture radicale avec l'art narratif, dans laquelle des feuilles en décomposition et des figues trop mûres portent le même poids moral qu'une allégorie religieuse. Le carton préparatoire monumental de Raphaël pour L'École d'Athènes (1509–1510) occupe un mur entier ; avec ses quelque 7,6 mètres de largeur, il s'agit du plus grand dessin de la Renaissance connu ayant survécu, révélant chaque repentir et chaque révision compositionnelle que Raphaël apporta avant de transposer le dessin sur la Stanza della Segnatura du Vatican. La galerie conserve également des œuvres importantes du Titien, Botticelli, Bramantino et Jan Brueghel l'Ancien, dont les peintures florales réalisées en collaboration avec Rubens témoignent des échanges artistiques entre les mondes flamand et italien que Borromeo encouragea activement.
Le trésor le plus singulier du musée est toutefois le Codex Atlanticus — un recueil relié de 1 119 feuilles de dessins et d'écrits de Léonard de Vinci, rassemblés par le sculpteur Pompeo Leoni entre 1582 et 1590. Nommé d'après ses dimensions proches d'un atlas, il couvre six décennies de la production de Léonard (v. 1478–1519) et englobe des études sur le vol, l'hydraulique, le génie militaire, la botanique et la géométrie. Napoléon le réquisitionna pour Paris en 1796 ; il fut restitué à Milan en 1815, l'une des rares œuvres majeures à avoir survécu intacte aux réquisitions françaises. Les visiteurs peuvent consulter des pages en fac-similé présentées en rotation, ce qui donne une perception directe de l'intellect agité et transdisciplinaire de Léonard.
Comparée à la Brera de Milan ou aux Offices de Florence, l'Ambrosienne accueille des foules relativement modestes, ce qui confère à la visite un caractère inhabituellement intime — des salles aux plafonds à caissons en bois et à l'éclairage chaud et maîtrisé permettent une étude tranquille des œuvres individuelles. Prévoyez 1h30 à 2 heures. Le musée est situé Piazza Pio XI 2, à quelques pas de la station de métro Duomo (M1/M3). Il est conseillé de réserver ses billets à l'avance le week-end, mais ils sont rarement épuisés en semaine le matin. La Bibliothèque Ambrosienne, accessible depuis le musée, nécessite un rendez-vous de recherche séparé pour les chercheurs, mais la façade de sa salle de lecture est visible depuis la cour intérieure.